Câu chuyện về Ba Nữ Thám Tử - Totally Spies nói về ba nữ điệp viên siêu hạng là Sam, Clover và Alex, mỗi người mang đặc điểm riêng nhưng cùng làm việc hiệu quả với nhau trong các nhiệm vụ. Mỗi khi nhận trách nhiệm bắt giữ tội phạm nguy hiểm trên toàn thế giới thông qua Jerry, người đứng đầu của WOOHP - Tổ chức Quốc tế Bảo vệ Con người. Dù Jerry thường khó tính nhưng thực ra lại rất sợ mẹ, và anh đã tiếp tục giấu mẹ về vai trò lãnh đạo tại WOOHP, nói dối rằng mình là chủ khách sạn. Mẹ của ba nữ điệp viên đã biết về công việc bí mật của con mình nên đã mua cho họ một ngôi nhà lớn gần trường học. Ngoài ra, Sam, Clover và Alex cũng trải qua cuộc sống hằng ngày như bất kỳ cô gái nào khác, đi học, có bạn trai...
