Ba Nữ Thám Tử - Totally Spies tường thuật về cuộc sống của ba nữ siêu điệp viên thiếu niên là Sam, Clover và Alex, mỗi người có đặc điểm và phong cách riêng, nhưng hiệu quả khi họ hợp tác trong hoạt động tình báo. Chúng nhận nhiệm vụ từ Jerry, người lãnh đạo của tổ chức quốc tế WOOHP chuyên bảo vệ nhân loại. Jerry, dù cứng rắn ngoài bề, nhưng thực chất là một người con ngoan, che giấu sự thật với mẹ rằng anh ta là sếp của WOOHP, và thay vào đó tự xưng là chủ khách sạn. Mẹ của ba nữ điệp viên biết về công việc bí mật của con mình, nên đã mua cho họ một ngôi nhà lớn gần trường học. Đồng thời, Sam, Clover và Alex trải qua cuộc sống thường ngày giống như nhiều cô gái khác, đi học và tìm kiếm tình yêu...
